kromatografi

Kromatografi, samlenavn på en stor gruppe av separasjons- og analysemetoder basert på at stoffene som skal atskilles, fordeler seg kontinuerlig mellom en stasjonær og en mobil fase. Separasjon av stoffer i en prøve skyldes forskjeller i stoffenes kjemiske og fysiske egenskaper, og gjør at de holdes mer eller mindre tilbake på stasjonærfase når prøven transporteres med mobilfasen gjennom stasjonærfasen.

Det var den russiske botanikeren Mikhail Tswett som først lanserte begrepet kromatografi og som først benyttet metoden til å separere plantepigmenter. Det har vært en enorm utvikling av kromatografien siden Tswett introduserte teknikken i 1903. I dag finnes det mange forskjellige kromatografiske metoder som gjør det mulig å separere og bestemme stoffer i de mest komplekse prøver. Separasjonen foregår oftest i en kolonne med stasjonær fase, men den kan også utføres på en plate med et tynt sjikt av stasjonær fase, på et spesialpapir og i den senere tid også på mikrobrikker. Den stasjonære fasen kan være et fast stoff eller en væske; den mobile fasen en gass, væske eller superkritisk fluid.

En separasjons- og analysemetode som er beslektet med kromatografi, er elektroforese hvor ioniske eller ioniserbare stoffer kan separeres pga. forskjellig mobilitet i et pålagt elektrisk felt.

Den tidligste formen for kromatografi var adsorpsjonskromatografi hvor et finfordelt fast adsorpsjonsmiddel, pakket i en kolonne eller søyle, utgjorde stasjonærfasen og en væske mobilfasen. Separasjonen foregikk til å begynne med uten instrumentering og kun enkle separasjoner og analyser var mulig. En liten mengde prøve, som inneholder stoffene A, B og C påsettes på toppen av kolonnen. Når en egnet mobilfase strømmer gjennom kolonnen, vil prøven bevege seg med mobilfasen. De ulike stoffene i prøven vil bevege seg med ulik hastighet gjennom kolonnen pga. forskjellig grad av affinitet til den stasjonære fasen, og separasjon mellom komponentene (her: A, B og C) i prøven finner sted. De stoffene som har størst affinitet til stasjonærfasen, vil holdes tilbake i lengre tid og kommer senere ut av kolonnen (fig. a). Gjennomstrømning med mobilfase (elueringen) foregår vanligvis så lenge at alle prøvekomponentene kommer ut av kolonnen. Eluatet fra kolonnen kan samles opp i fraksjoner som deretter analyseres med en egnet metode. Dersom stoffene i prøven har farge (som i Tswetts tilfelle), kan separasjonen følges visuelt og kun de fraksjonene som inneholder stoffer fra prøven, samles opp.

I instrumentelle metoder benytter man en detektor plassert etter kolonnen. Den registrerer stoffene direkte etter hvert som de kommer ut. Signalene fra detektoren, i form av et kromatogram, registreres med en skriver eller datamaskin. I moderne instrumentell kromatografi benytter man et datasystem til styring, registrering av kromatogram og databehandling. Tiden det tar for et stoff å bevege seg gjennom kolonnen (retensjonstiden) medvirker til å identifisere stoffet (kvalitativ analyse). Dette gjøres ved å sammenligne retensjonstiden for det ukjente stoffet med retensjonstidene til kjente stoffer kromatografert under de samme betingelsene. Høyden eller arealet til signalet er grunnlaget for å bestemme mengden eller konsentrasjonen av stoffene i prøven (kvantitativ analyse).

I fordelingskromatografi er stasjonærfasen en væske, som kan være bundet til et fast stoff (bæresubstans) eller være impregnert på innsiden av en kolonne. Mobilfasen kan være en væske eller en gass. Prinsippet for fordelingskromatografi hvor begge fasene er væsker (ikke blandbare), tilsvarer prinsippet for væske–væske-ekstraksjon (se ekstraksjon). Det var to britiske kjemikere, Richard Synge og Archer Martin, som først introduserte fordelingskromatografi (væske som stasjonærfase). De fikk Nobelprisen i kjemi 1952 for dette arbeidet.

I ionebytterkromatografi benyttes en såkalt ionebytter som stasjonærfase. En ionebytter består av et uløselig, polymert materiale som inneholder ioniske grupper som pga. elektrostatisk tiltrekning har knyttet til seg ioner med motsatt ladning (motioner). Motionene kan byttes ut med andre ioner fra mobilfase og prøve. En ionebytter med kationer som motioner kalles kationbytter og benyttes til å separere kationer. Tilsvarende har en anionbytter utbyttbare anioner og kan benyttes til å separere anioner. Separasjonen av stoffer (ioner og ioniserbare forbindelser) forekommer pga. ulik grad av affinitet (elektrostatisk tiltrekning) til den stasjonære fases ioniske grupper. Som mobilfase anvendes som regel vandige løsninger av salter, syrer eller baser. Ionebytterkromatografi kan utføres uten avansert instrumentering (på kolonner eller på tynnsjiktplater) eller ved bruk av instrumentelle metoder (HPLC med en ionebytterkolonne, se Instrumentelle metoder, Væskekromatografi). Ionekromatografi er betegnelse på en instrumentell analysemetode for separasjon av anioner og kationer. Se også ionebyttere.

I eksklusjonskromatografi separeres stoffene etter molekylstørrelsen. Denne type kromatografi kan utføres uten avansert instrumentering eller ved bruk av HPLC. Stasjonærfasen består av et partikulært, porøst materiale med en gitt porestørrelse. Molekyler som er større enn porene, kan bare bevege seg mellom partiklene (de ekskluderes) og vil komme først ut av kolonnen. Tilstrekkelig små molekyler vil diffundere ut og inn av porene. De minste molekylene, som kan bevege seg lengst inn i porene, vil forsinkes mest og komme ut av kolonnen til slutt. Dersom mobilfasen er vandig, betegnes også metoden som gelfiltrering eller gelkromatografi. Hvis mobilfasen er et organisk løsningsmiddel, kalles den også gelpermeasjonskromatografi.

Kromatografi kan utføres enkelt uten bruk av instrumentering: på en kolonne eller ved bruk av såkalte planare kromatografiske metoder.

I tynnsjiktkromatografi (TLC, av eng: thin layer chromatography) er stasjonærfasen pålagt som et tynt sjikt av partikulært materiale på en rektangulær plate. Mobilfasen er en væske. Separasjonsprinsippet som benyttes i TLC, er avhengig av type stasjonærfase og kan være adsorpsjons-, fordelings-, ionebyttings- eller eksklusjonskromatografi. Prøver påsettes nær og like langt fra den ene sidekanten av tynnsjiktplaten sammen med aktuelle kjente stoffer (standarder for sammenligning og mulig identifikasjon av stoffene i prøven). Platen settes ned i et lukket kar som inneholder mobilfasen, slik at mobilfasen ikke når opp til de påsatte stoffene. Mobilfasen vil pga. kapillærkrefter trekke seg oppover i sjiktet på platen, og stoffene i prøven vil transporteres med mobilfasen med forskjellig hastighet pga. ulik grad av interaksjon. Før mobilfasen har nådd den øvre platekanten, tas platen ut og tørkes. Komponentene kan påvises direkte dersom de har farge, eller de kan detekteres med en egnet metode (f.eks. fremkalling med fargereagenser). De separerte stoffene kan også skrapes av platen og deretter identifiseres og kvantifiseres. Sammenligning av vandringsavstander for de separerte stoffene i prøven med vandringsavstander for kjente stoffer (standarder påsatt platen) gir grunnlag for identifikasjon av de forskjellige stoffene i prøven. TLC er normalt en enkel og billig metode som ofte benyttes for renhetstesting eller for en rask «screening» av stoffsammensetningen av prøver.

I papirkromatografi benytter man et egnet filterpapir som bærer for stasjonærfasen, f.eks. vann adsorbert på filterpapiret. Utførelsen, dvs. påsetting av prøver/standarder, kromatografering og deteksjon foregår omtrent på samme måte som i tynnsjiktkromatografi. Papirkromatografi er ikke mye i bruk i dag, men egner seg godt til å illustrere kromatografi med enkelt utstyr.

Gasskromatografi (GC) utføres alltid som kolonnekromatografi. Kolonnen består av et langt tynt rør (vanligvis 3–50 m) hvor stasjonærfasen er en væske med høyt kokepunkt. Den er impregnert på et fast, porøst stoff (bærer) eller dekker innsiden av en kapillærkolonne (diameter 0,05–0,3 mm). Stasjonærfasen kan også være et fast adsorpsjonsmiddel. I dag utføres nesten all gasskromatografi på kapillærkolonner. Mobilfasen er en inert gass (bæregass). Analyseinstrumentet kalles gasskromatograf og består av en høytrykksylinder med bæregass (vanligvis hydrogen eller helium), en injektor for prøveinnføring, en kveilet kolonne plassert i en ovn, en detektor og en skriver (eller datasystem). Litt av prøven (fast, væske eller gass), sprøytes inn i det oppvarmede injeksjonskammeret hvor den fordamper. Bæregassen som strømmer gjennom kammeret, bringer prøven med seg inn i den oppvarmede kolonnen hvor den separeres og videre gjennom detektoren hvor de enkelte komponentene registreres. Kolonnetemperaturen må tilpasses de stoffene som skal separeres/bestemmes. Pga. forskjellig fordeling mellom væske og gass vil de enkelte stoffene i prøven komme ut til forskjellig tid. Separasjonen skjer hovedsakelig etter stoffenes kokepunkter: stoffer som har lavt kokepunkt vil vandre raskere gjennom kolonnen enn de med høyere kokepunkt. Detektoren gir en respons som er proporsjonal med mengden eller konsentrasjonen av stoffene. Flere typer detektorer kan benyttes, f.eks. flammeionisasjonsdetektor.

Enkel væskekromatografi (LC) kan utføres uten avansert instrumentering; på en stående kolonne, ved bruk av papir eller en tynnsjiktplate. For mer krevende analyser benyttes HPLC (eng., high performance liquid chromatography) som er en instrumentell analyseteknikk. Instrumentet som benyttes kalles væskekromatograf og består grovt sett av: mobilfasereservoar, høytrykkspumpe, injektor, separasjonskolonne, detektor og skriver (eller mer vanlig et datasystem, fig. c). Kolonnen er pakket med svært små partikler for å få gode separasjonsegenskaper. En høytrykkspumpe må derfor benyttes for å pumpe væske (mobilfase) gjennom systemet.

Alle separasjonsprinsippene (adsorpsjon, fordeling, ionebytting og eksklusjon) benyttes i HPLC. Det finnes et stort antall forskjellige kolonner som varierer med hensyn til dimensjoner, pakkemateriale, type stasjonær fase osv. Indre diameter og lengde på en vanlig analytisk kolonne er vanligvis i området 2–5 mm diameter og 3–25 cm lengde. Detektorene, er blant annet basert på måling av UV-absorpsjon, brytningsindeks og fluorescens. Måling av UV-absorpsjon med et spektrometer med en gjennomstrømningskyvette er mest benyttet.

Superkritisk fluid kromatografi (SFC) er en instrumentell analyseteknikk hvor lignende utstyr som væskekromatografen benyttes (både HPLC og GC detektorer kan benyttes). Som mobilfase anvendes en komprimert gassfase ved en temperatur og et trykk over de kritiske (se superkritisk fluid). SFC har et anvendelsesområde som overlapper både med GC og HPLC.

Kromatografi er en meget effektiv metode for å atskille stoffer og benyttes i noen tilfeller bare for opprensning av prøver, men oftere for analyse. Ved valg av egnet kromatografisk teknikk og optimalisering av separasjonsbetingelser kan de mest komplekse prøver, inkludert prøver som inneholder forbindelser med svært like egenskaper, separeres. Kromatografiske metoder kan benyttes til separasjon og bestemmelse av både organiske og uorganiske forbindelser, men anvendelsen er størst for organiske stoffer.

GC og HPLC er de kromatografiske metodene som benyttes mest. Begge metodene kan automatiseres. Stoffmengder som foreligger i konsentrasjonen lavere enn 10^–15 g/ml kan detekteres med disse metodene. Stoffer som skal analyseres med gasskromatografi må være flyktige og stabile ved den temperaturen som benyttes (som regel lavere enn 350 °C). Et viktig bruksområde for GC er bl.a. analyse av aromastoffer, oljer, gasser og alkoholer. HPLC har et større anvendelsesområde enn GC og kan også benyttes til forbindelser med høy molekylvekt og høyt kokepunkt. HPLC kan f.eks. benyttes for å kontrollere medikamenter og metabolitter i blod, til å måle naturlige forekommende spesier i kroppsvæsker og celler, til å bestemme gener, proteiner og metabolitter som er karakteristiske for arvelige sykdommer, til å bestemme næringsstoffer og giftige stoffer i matvarer, til å overvåke miljøet, til å kontrollere industrielle prosesser og måle kvaliteten av produktene. Se også analyse.