förster resonansenergioverføring

Med FRET kombinert med fluoroforer brukt i konfokal mikroskopi kan man kartlegge meget små detaljer i de tredimensjonale strukturene i en celle, blant annet endringer i proteiner eller membraner.

Förster resonansenergioverføring anvendt på lysenergi må oppfylle tre betingelser:

1. Det må være overlappende fluorescensbånd fra donormolekylet som skal avgi eksitasjonsenergi og absorbsjonsbånd til akseptormolekylet (Förster overlappende integral). Sannsynligheten for energioverføring av eksitonet (eksitasjonsenergien) påvirkes av i hvilken grad fluorescensspekteret fra det ene eksiterte donormolekylet dekker og overlapper absorbsjonsspekteret til det andre akseptormolekylet.
2. Donor- og akseptor-molekylene må ligge tredimensjonalt så nær hverandre, avstand 5 til 10 nanometer (nm), slik at det kan skje en dipol-dipol interaksjon, resonans og strålingsløs energioverføring mellom donor og akseptor. Det er altså ingen fluorescens fra dononormolekylet, kun interne energibevegelser i molekylet. Energioverføringen er proporsjonal med 1/r⁶, hvor r er avstanden mellom sentrum av dipolene. Dipol-dipolkoblingen og overlappende absorbsjonsbånd er avhengig av avstanden mellom dem, og i hvilken grad det kan skje Coulombinteraksjon mellom ladninger.
3. Energioverføringen er bare mulig i en retning, fra eksitasjonstilstand tilsvarende korte bølgelengder, til energitilstand tilsvarende lengre bølgelengder.

Et eksitert klorofyllmolekyl med en oscillerende elektrisk dipol-dipolkobling til et mottakterklorofyll gir et varierende elektromagnetisk felt og energioverføring uten stråling. Energien (eksitonet) blir overført fra det laveste eksiterte energinivået til for eksempel hjelpepigmentet klorofyll b over til et eksitasjonsnivå i klorofyll a, som nødvendigvis ikke er det laveste nivået for klorofyll a.

Vibrasjoner i det eksiterte klorofyll b sprer energi via indre energiomvandling og det eksiterte π-elektronet faller til laveste første singlett, til et stadium hvor det blir resonans med et vibrerende klorofyll a og eksitasjonsenergien forflyttes over til et klorofyll a. Förster energiresonansoverføring forklarer intern overføring av lysenergi mellom klorofyll a-molekyler i proteinkompleksene, eller fra klorofyll b til klorofyll a i grønnalger, proklorofytter og planter, samt hvordan grønt lys absorbert av fykoerytrin i rødalger via resonans blir overført til fykocyanin (absorberer oransj lys), videre til allofykocyanin (absorberer rødt lys) og videre til klorofyll a.

Det samme gjelder lysenergi absorbert av fucoxantin i brunalger og diatomeer blir overført til klorofyll a, samt bakterieklorofyll som absorberer elektromagntisk stråling med bølgelengde 800 til 850 nm kan bli overført via resonans til bakterieklorofyll som absorberr ved 890 nm.

FRET-mikroskopi er også noe misvisende blitt kalt fluorescens resonansenergioverføring, i stedet for Förster, for et viktig poeng er at energioverføringen ikke involverer fluorescens som sådan. Imidlertid er det slik at fluorescensspekteret for donormolekylet er overlappende med eksitasjonsspekteret for mottakermolekylet.

Ved vanlig fluorescensmikroskopi er det en fluorofor som blir eksitert med for eksempel blått lys som passerer et interferensfilter. Eksitasjonsenergien i fluoroforen blir umiddelbart sendt ut (emittert) som fluorescens, ofte med mye lenger bølgelengde enn eksitasjonslyset, for eksempel gul, grønn, oransje eller rød, som passerer et interferensfilter tilpasset bølgelengden av lyset man skal se på.

Det er altså stor forskjell i bølglengdetopp mellom ekistasjonsspekteret og emmisjonsspekteret (fluorescensspekteret). Fluorscensmikroskopi har ikke så god oppløsning som FRET-mikroskopi, hvor det er strålingsløs overføring av eksitasjonsenergi, en dipol-dipol interaksjon med avstand 2 – 5 nanometer (nm) mellom fluoroforene, for eksempel grønt-, gult- og cyan-fluorescerende protein.

Franck-Condon-prinsippet (den amerikanske atomfysikeren Edward Uhler Condon (1902-1974) forklarer hvordan det skjer samtidige endringer i vibrasjonsenergi (oscillasjonsenergi) og elektronisk energi i et molekyl hvor et elektron mottar energien fra et lyskvant og blir eksitert. Eksitert vil si at elektron blir flyttet fra et lavere til et høyere energinivå. I molekyler kan et π-elektron i konjugerte karbon-karbon dobbeltbindinger, to elektroner med motsatt spin (↑↓) i hvert sitt π-orbital. bli eksitert til et singlettnivå, eller til et lavere triplettnivå med spinreversering av et elektron.

Den tyske fysikeren James Franck (1882-1964) delte nobelprisen i fysikk i 1925 med Gustav Hertz, «for oppdagelsen av lover for hvordan elektroner påvirker et atom» og fant eksperimentelle bevis for kvanteteorien. Sammen med Hertz gjorde Franck eksperimenter for å studere fluorescens ved å sende energirike elektroner gjennom et vakuumrør med litt kvikksølvdamp. Ved absorbsjon av lys i fotosyntesen kan eksitasjonsenergien bli overført til nærliggende pigmentmolekyler via FRET, eller som et lyskvant (fluorescens), når elektronet i molekylet faller tilbake til grunntilstanden, for eksempel utsendelse av rødt fluorescenslys fra klorofyll.

Energioverføringer i et elektron fra en energitilstand til en annen skjer umiddelbart sammenlignet med de mer sakte vibrasjonene i atomkjernene som svinger fram og tilbake og ligner på en pendelanalogi. Sannsynligheten for en slik elektrontransisjon (overføring fra et elektrons energinivå til et annet) er størst når atomkjernen er i bunnen av pendelsvingningen (bunnen av bevegelsesbrønnen). Det skjer endring i vibrasjoner når et elektron i molekylet blir eksitert.

Kvantemekanisk har elektroner en superposisjon, og man har stilt seg spørsmålet om eksitonet beveger seg tilfeldig mellom pigmentmolekylene i proteinkompleksene fram til reaksjonssenteret ved virrevandring, eller om det har en mer målrettet bevegelse som fører fram til ladningsseparasjon hvor et elektron blir overført til feofytin og lysenergien er fanget i form av kjemisk energi. Imidlertid følges elektronene av protoner i en protonhopping, og uansett er energioverføringen meget effektiv.

Vibrasjoner i det eksiterte klorofyll b dissiperer energi via indre energiomvandling og det eksiterte π-elektronet faller til laveste første singlett, til et stadium hvor det blir resonans med et vibrerende klorofyll a og eksitasjonsenergien forflyttes over til et klorofyll a.

• fotosyntese