DNA-sekvensering

Teknikker for å lese av baseparenes rekkefølge, DNA-sekvensering, gir oss tilgang til den genetiske koden. Den hyppigst benyttede teknikken i dag er såkalt dideoksysekvensering eller Sanger-sekvensering, oppkalt etter Frederick Sanger som utviklet metoden. I denne teknikken benyttes en DNA-polymerase, som i reagensrøret kan lage en kopi av en DNA-bit (templatet). Et tilsatt syntetisk oligonukleotid benyttes som primer og bestemmer hvor kopieringen skal begynne. Som byggesteiner benyttes de fire deoksyribonukleosidtrifosfatene, men man tilsetter også en analog av en av disse. Denne mangler hydroksygruppen i 3-stilling i deoksyribosegruppen. Dette dideoksynukleosidtrifosfatet vil innføres i den voksende DNA-tråden i konkurranse med det tilsvarende normale nukleosidtrifosfatet.

Voksende DNA-tråder som har fått innført analogen, vil ikke kunne vokse videre. Resultatet av reaksjonen vil altså bli at man får dannet en serie med DNA-fragmenter som alle begynner i samme primersete og som avsluttes av samme dideoksynukleotid. Baserekkefølgen i det tilsatte templat-DNA vil bestemme i hvilke posisjoner dideoksynukleotidet kan innføres og derved størrelsen av DNA-fragmentene som dannes. Fragmentstørrelsene kan bestemmes ved at man skiller fragmentene fra hverandre ved elektroforese. Ved å utføre fire forskjellige reaksjoner, hver med ett av de fire dideoksyribonukleosidtrifosfatene til stede, og analysere de fire reaksjonene ved elektroforese, vil man observere en såkalt sekvensstige hvor baserekkefølgen i DNA-tråden kan avleses direkte. For at man skal kunne oppdage fragmentene, må de være merket. Tidligere benyttet man radioaktiv merking, men nå bruker man vanligvis fluorescensmerking.

Moderne instrumenter for DNA-sekvensering kan analysere flere hundre templat-DNA samtidig og avlese 500–1000 baser for hver reaksjon. Det humane genom ble avlest i fabrikker med hundrevis av slike instrumenter.