I eksklusjonskromatografi separeres stoffene etter molekylstørrelsen. Denne type kromatografi kan utføres uten avansert instrumentering eller ved bruk av HPLC. Stasjonærfasen består av et partikulært, porøst materiale med en gitt porestørrelse. Molekyler som er større enn porene, kan bare bevege seg mellom partiklene (de ekskluderes) og vil komme først ut av kolonnen. Tilstrekkelig små molekyler vil diffundere ut og inn av porene. De minste molekylene, som kan bevege seg lengst inn i porene, vil forsinkes mest og komme ut av kolonnen til slutt. Dersom mobilfasen er vandig, betegnes også metoden som gelfiltrering eller gelkromatografi. Hvis mobilfasen er et organisk løsningsmiddel, kalles den også gelpermeasjonskromatografi.