Det er karakteristisk for proteinene at de har en veldefinert romlig struktur, konformasjon, noe som er vist ved røntgenkrystallografiske undersøkelser. Det er gjennom sin bestemte romlige struktur at hvert protein får de biologiske egenskaper som særpreger det. Den fullt utstrakte polypeptidkjede er uten biologisk aktivitet. Men under optimale betingelser folder den seg til den aktive konformasjonen, en prosess som styres av sidekjedenes egenskaper. Vi forstår da at genene, via proteinenes primærstruktur, også bestemmer proteinenes romlige struktur og egenskaper.
Polypeptidkjeden foldes slik at det oppstår hydrogenbindinger (se hydrogenbinding) mellom nærstående peptidbindinger:
På denne måten kan det dannes en rett, skrueformet sekundærstruktur som kalles α-heliks, oppdaget av L. Pauling.
Spiralformen opprettholdes av hydrogenbindinger mellom amidgruppen i en peptidbinding og karbonyloksygenet i peptidbindingen hos den fjerde neste aminosyre. Hver omdreining langs spiralen inneholder gjennomsnittlig 3,6 aminosyrerester. Sidekjedene, R-gruppene, vender utover fra spiralaksen. α-keratin i hår og ull består av slike α-helikser.
I silke finnes det en annen form for sekundærstruktur, foldete plater, stabilisert av hydrogenbindinger mellom amidnitrogen og karbonyloksygen i forskjellige polypeptidkjeder. I bindevevets kollagen finner vi en sekundærstruktur som bygger på at tre kjeder er tvunnet om hverandre.
Proteinene i hår, silke og bindevev har fiberstruktur og ingen romlig struktur utover den rettlinjede sekundærstruktur. Fibrene fremkommer ved at flere peptidkjeder ligger ved siden av og i forlengelse av hverandre. De fiberaktige proteiner er uløselige i vann og saltløsninger. På grunn av sin spesielle struktur har de stor strekkfasthet.
I den andre hovedgruppen av proteiner, de globulære proteiner, er peptidkjeden foldet videre, slik at formen på molekylet blir tilnærmet rund (se tegning av enzymet karboksypeptidase under enzymer). Disse proteiner løser seg lett i vann og saltløsninger. De fleste proteiner hører med til denne gruppen.
I tillegg til hydrogenbindinger mellom nærstående aminosyrer i områder med α-heliks har de globulære proteiner andre intramolekylære bindinger mellom fjernere deler av polypeptidkjeden. Disse bindingene bygger opp den såkalte tertiærstrukturen. Store proteinmolekyler inneholder gjerne to eller flere polypeptidkjeder, underenheter, som er bundet i et kompleks. Vi snakker i slike tilfeller om proteinets kvartærstruktur. Kvartærstrukturen holdes sammen av samme slags bindinger som tertiærstrukturen. Hemoglobin er et eksempel (se biokjemi). I oppklaring av proteiners tertiær- og kvartærstruktur har J. C. Kendrew og M. F. Perutz spilt en ledende rolle.
Proteinsekvensering
Rekkefølgen eller sekvensen av aminosyrer i et protein kan bestemmes ved såkalt Edman-degradering, hvor en og en aminosyre fjernes fra proteinets aminoende og identifiseres. I dag bestemmes gjerne proteinsekvenser ved å sekvensere DNA som koder for proteinet og utlede aminosyresekvensen ved hjelp av den genetiske kode.